Ядерный эффект Оверхаузера — Nuclear Overhauser effect
Ядерный эффект Оверхаузера ( NOE ) является передача спиновой поляризации ядерной из одной популяции спиновых-активных ядер (например , 1 H, 13 C, 15 N и т.д.) к другому через кросс-релаксации . Феноменологическое определение NOE в спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — это изменение интегральной интенсивности (положительной или отрицательной) одного резонанса ЯМР, которое происходит, когда другой насыщается облучением радиочастотным полем . Изменение резонансной интенсивности ядра является следствием того, что ядра находятся в пространстве, близком к тем, на которые непосредственно влияет РЧ-возмущение.
NOE особенно важен для определения резонансов ЯМР, а также для выяснения и подтверждения структур или конфигураций органических и биологических молекул. Двумерный эксперимент NOE SpectroscopY (NOESY) является важным инструментом для определения стереохимии белков и других биомолекул в растворе, тогда как в твердой форме для определения стереохимии необходимо использовать дифракцию рентгеновских лучей на кристаллах.
СОДЕРЖАНИЕ
История
NOE развился на основе теоретической работы американского физика Альберта Оверхаузера, который в 1953 году предположил, что поляризация ядерных спинов может быть усилена микроволновым облучением электронов проводимости в некоторых металлах. Электронно-ядерное усиление, предсказанное Оверхаузером, было экспериментально продемонстрировано в металле 7 Li Т. Р. Карвером и С. П. Слихтером также в 1953 году. Общая теоретическая основа и экспериментальное наблюдение эффекта Оверхаузера, включающего только ядерные спины в молекуле HF, были опубликованы Ионелем Соломоном в работе 1955. Другое раннее экспериментальное наблюдение NOE было использовано Кайзером в 1963 году, чтобы показать, как NOE можно использовать для определения относительных знаков скалярных констант связи и для отнесения спектральных линий в спектрах ЯМР к переходам между уровнями энергии. В этом исследовании резонанс одной популяции протонов ( 1 H) в органической молекуле был усилен, когда вторая отдельная популяция протонов в той же органической молекуле была насыщена радиочастотным излучением. Применение NOE было использовано Анет и Борном в 1965 году для подтверждения назначений ЯМР-резонансов для β, β-диметилакриловой кислоты и диметилформамида, показало, что информация о конформации и конфигурации органических молекул может быть получена. Белл и Сондерс сообщили о прямой корреляции между усилением NOE и межъядерными расстояниями в 1970 году, в то время как о количественных измерениях межъядерных расстояний в молекулах с тремя или более спинами сообщили Schirmer et al.
Ричард Р. Эрнст был удостоен Нобелевской премии по химии 1991 года за разработку преобразования Фурье и двумерной ЯМР-спектроскопии , которая вскоре была адаптирована для измерения NOE, особенно в больших биологических молекулах. В 2002 году Курт Вутрих получил Нобелевскую премию по химии за разработку спектроскопии ядерного магнитного резонанса для определения трехмерной структуры биологических макромолекул в растворе, демонстрируя, как метод 2D NOE (NOESY) может использоваться для ограничения трехмерного структуры крупных биологических макромолекул. Профессор Анил Кумар был первым, кто применил эксперимент с двумерным ядерным эффектом Оверхаузера (2D-NOE, теперь известный как NOESY) к биомолекуле, который открыл поле для определения трехмерных структур биомолекул в растворах с помощью ЯМР-спектроскопии.
Расслабление
NOE и ядерная спин-решеточная релаксация являются тесно связанными явлениями. Для одного спина — 1 / 2 ядра в магнитном поле есть два уровня энергии, которые часто называют α и β, которые соответствуют два возможным спинам квантовых состояний, + 1 / 2 и — 1 / 2 , соответственно , . При тепловом равновесии населенность двух энергетических уровней определяется распределением Больцмана со спиновыми населенностями, задаваемыми P α и P β . Если спиновые населенности возмущены соответствующим радиочастотным полем на частоте энергии перехода, спиновые населенности возвращаются к тепловому равновесию в результате процесса, называемого спин-решеточной релаксацией . Скорость переходов от а к р пропорциональна популяции состояние a, P & alpha ; , а также является первым процессом порядка с постоянной скоростью W . Условие, при котором спиновые населенности уравновешиваются непрерывным радиочастотным излучением ( P α = P β ), называется насыщением, и резонанс исчезает, поскольку вероятности перехода зависят от разности населенностей между уровнями энергии.
В простейшем случае , когда НЭ имеет отношения, резонансы двух спины — 1 / 2 ядер, I и S, химически сдвинуты , но не J связь . Энергетическая диаграмма для такой системы имеет четыре энергетических уровня, которые зависят от спиновых состояний I и S, соответствующих αα, αβ, βα и ββ соответственно. В W» ы являются вероятности в единицу времени , что переход будет иметь место между четырьмя уровнями энергии, или в других терминах скорости , при которой соответствующая спина переворачивает происходит. Имеются два одиночных квантовых перехода, W 1 I , соответствующие αα ➞ αβ и βα ➞ ββ; W 1 S , что соответствует αα ➞ βα и βα ➞ ββ; нулевой квантовый переход W 0 , соответствующий βα ➞ αβ, и двойной квантовый переход, соответствующий αα ➞ ββ.
В то время как радиочастотное излучение может вызывать только одноквантовые переходы (из-за так называемых квантово-механических правил отбора ), дающие начало наблюдаемым спектральным линиям, диполярная релаксация может происходить по любому из путей. Диполярный механизм — единственный распространенный механизм релаксации, который может вызывать переходы, в которых меняется более одного спина. В частности, механизм диполярной релаксации вызывает переходы между состояниями αα и ββ ( W 2 ) и между состояниями αβ и βα ( W 0 ).
Выраженный через их объемные намагниченности ЯМР, экспериментально наблюдаемый стационарный NOE для ядра I, когда резонанс ядра S насыщен ( ), определяется выражением: M S знак равно 0 <\ displaystyle M_ = 0> 
η я S знак равно ( M я S — M 0 я M 0 я ) <\ displaystyle \ eta _ ^ = \ left ( <\ frac -M_ <0i>>
где — намагниченность (резонансная интенсивность) ядра при тепловом равновесии. Аналитическое выражение для NOE можно получить, рассматривая все пути релаксации и применяя уравнения Соломона для получения M 0 я <\ displaystyle M_ <0i>> я <\ displaystyle I>
η я S знак равно M я S — M 0 я M 0 я знак равно γ S γ я σ я S ρ я знак равно γ S γ я ( W 2 — W 0 2 W 1 я + W 0 + W 2 ) <\ displaystyle \ eta _ ^ = <\ frac -M_ <0i>> > <\ gamma _ >> <\ frac <\ sigma _ > <\ gamma _ > > \ left ( <\ frac
ρ я знак равно 2 W 1 я + W 0 + W 2 <\ displaystyle \ rho _ = 2W_ <1>^ + W_ <0>+ W_ <2>> и . σ я S знак равно W 2 — W 0 <\ displaystyle \ sigma _
ρ я <\ displaystyle \ rho _ > это общая скорость продольной релаксации дипольной ( ) спин I из — за наличие спина s , называются как кросс-релаксация скорость, а также и являются гиромагнитными отношениями , характерные для и ядер, соответственно. 1 / Т 1 <\ displaystyle 1 / T_ <1>> σ я S <\ displaystyle \ sigma _ γ я <\ displaystyle \ gamma _ > γ S <\ displaystyle \ gamma _ > я <\ displaystyle I> S <\ displaystyle S>
Насыщение вырожденных переходов W 1 S нарушает равновесные населенности, так что P αα = P αβ и P βα = P ββ . Тем не менее, пути релаксации системы остаются активными и действуют, чтобы восстановить равновесие, за исключением того, что переходы W 1 S не имеют значения, потому что различия населенностей на этих переходах фиксируются радиочастотным излучением, в то время как разница населенностей между переходами W I делает не изменяются от своих равновесных значений. Это означает, что если бы только одиночные квантовые переходы были активными как пути релаксации, насыщение резонанса не повлияло бы на интенсивность резонанса. Следовательно, чтобы наблюдать NOE на резонансной интенсивности I, вклад и должен быть важным. Эти пути, известные как пути перекрестной релаксации , вносят значительный вклад в спин-решеточную релаксацию только тогда, когда в релаксации преобладают диполь-дипольные или скалярные взаимодействия взаимодействия, но скалярное взаимодействие редко играет важную роль и предполагается, что им можно пренебречь. В гомоядерном случае, когда if является доминирующим путем релаксации, то насыщение увеличивает интенсивность резонанса и NOE является положительным , тогда как если if является доминирующим путем релаксации, насыщение снижает интенсивность резонанса, а NOE является отрицательным . S <\ displaystyle S> я <\ displaystyle I> W 0 <\ displaystyle W_ <0>> W 2 <\ displaystyle W_ <2>> γ я знак равно γ S <\ Displaystyle \ gamma _ = \ gamma _ > W 2 <\ displaystyle W_ <2>> S <\ displaystyle S> я <\ displaystyle I> W 0 <\ displaystyle W_ <0>> S <\ displaystyle S> я <\ displaystyle I>
Молекулярное движение
Будет ли NOE положительным или отрицательным, во многом зависит от степени вращательного движения молекул. Три пути дипольной релаксации вносят вклад в разную степень спин-решеточной релаксации в зависимости от ряда факторов. Ключевым является то , что соотношение между & omega 2 , ω 1 и ω 0 в решающей степени зависит от молекулярного времени вращательной корреляции , , время, которое требуется молекула , чтобы повернуть один радиан. ЯМР теория показывает , что вероятности переходов связаны и частота прецессии ларморовской , , соотношения: τ c <\ displaystyle \ tau _ τ c <\ displaystyle \ tau _ ω <\ displaystyle \ omega>
W 1 я ∝ 3 τ c ( 1 + ω я 2 τ c 2 ) 1 р 6 <\ Displaystyle W_ <1>^ \ propto <\ frac <3 \ tau _ W 0 ∝ 2 τ c ( 1 + ( ω я — ω S ) 2 τ c 2 ) 1 р 6 <\ Displaystyle W_ <0>\ propto <\ frac <2 \ tau _ ) ^ <2>\ tau _ W 2 ∝ 12 τ c ( 1 + ( ω я + ω S ) 2 τ c 2 ) 1 р 6 <\ Displaystyle W_ <2>\ propto <\ frac <12 \ tau _ ) ^ <2>\ tau _
где это расстояние , разделяющее два спин — 1 / 2 ядра. Для того чтобы релаксация произошла, частота вращения молекул должна соответствовать ларморовской частоте ядра. В мобильных растворителях опрокидывание молекул происходит намного быстрее, чем . Так называемый предел экстремального сужения где ). В этих условиях двухквантовая релаксация ω 2 более эффективна, чем ω 1 или ω 0 , потому что τ c и 2ω 0 совпадают лучше, чем τ c и ω 1 . Когда ω 2 является доминирующим процессом релаксации, результат NOE положительный. р <\ displaystyle r> W 0 <\ displaystyle W_ <0>> ω τ c ≪ 1 <\ displaystyle \ omega \ tau _
W 1 я ∝ γ я 2 γ S 2 3 τ c р 6 <\ Displaystyle W_ <1>^ \ propto \ gamma _ ^ <2>\ gamma _ ^ <2><\ frac <3 \ tau _ W 0 ∝ γ я 2 γ S 2 2 τ c р 6 <\ displaystyle W_ <0>\ propto \ gamma _ ^ <2>\ gamma _ ^ <2><\ frac <2 \ tau _ W 2 ∝ γ я 2 γ S 2 12 τ c р 6 <\ displaystyle W_ <2>\ propto \ gamma _ ^ <2>\ gamma _ ^ <2><\ frac <12 \ tau _ η я S ( м а Икс ) знак равно γ S γ я [ 12 τ c р 6 — 2 τ c р 6 2 τ c р 6 + 2 3 τ c р 6 + 2 τ c р 6 ] знак равно γ S γ я [ 12 — 2 2 + 6 + 12 ] знак равно γ S γ я 1 2 <\ displaystyle \ eta _ ^ (max) = <\ frac <\ gamma _ > <\ gamma _ >> \ left [<\ frac <<\ frac <12 \ tau _ > <\ gamma _ >> \ left [ <\ frac <12-2><2 + 6 12>> \ right] = < \ frac <\ gamma _ > <\ gamma _ >> <\ frac <1><2>>>
Это выражение показывает, что для гомоядерного случая, когда I = S , особенно для 1 H ЯМР, максимальный наблюдаемый NOE составляет 1 \ 2 независимо от близости ядер. В гетероядерном случае, когда I ≠ S , максимальный NOE равен 1 \ 2 ( γ S / γ I ), что при наблюдении за гетероядерными ядрами в условиях широкополосной развязки протонов может привести к значительному повышению чувствительности. Наиболее важным примером в органической химии является наблюдение 13 C при развязке 1 H, которая также насыщает резонансы 1 Дж. Значение γ S / γ I близко к 4, что дает максимальное усиление NOE на 200%, давая резонансы в 3 раза более сильные, чем они были бы без NOE. Во многих случаях к атомам углерода присоединен протон, что приводит к тому, что в релаксации преобладает диполярная релаксация, а NOE приближается к максимуму. Для непротонированных атомов углерода усиление NOE невелико, в то время как для атомов углерода, релаксация которых происходит за счет механизмов релаксации, отличных от диполь-дипольных взаимодействий, усиление NOE может быть значительно уменьшено. Это одна из причин использования дейтерированных растворителей (например, CDCl 3 ) в 13 C ЯМР. Поскольку дейтерий релаксирует по квадрупольному механизму, пути перекрестной релаксации отсутствуют, и NOE не существует. Другой важный случай — это 15 Н, пример, когда значение его магнитогирического отношения отрицательно. Часто резонансы 15 N уменьшаются, или NOE может фактически обнулить резонанс, когда ядра 1 H разделены. Обычно выгодно снимать такие спектры с помощью импульсных методов, которые включают передачу поляризации от протонов к 15 N, чтобы минимизировать отрицательный NOE.
Выяснение структуры
Хотя связь стационарного NOE с межъядерным расстоянием является сложной, в зависимости от скоростей релаксации и молекулярного движения, во многих случаях для небольших быстро падающих молекул в пределе экстремального сужения полуколичественная природа положительных NOE полезна для многих структурных приложений. часто в сочетании с измерением констант J-связи. Например, улучшения NOE можно использовать для подтверждения назначений резонанса ЯМР, различения структурных изомеров, идентификации паттернов замещения ароматических колец и конфигураций алифатических заместителей, а также определения конформационных предпочтений.
Тем не менее, межатомные расстояния, полученные из наблюдаемого NOE, часто могут помочь подтвердить трехмерную структуру молекулы. В этом приложении NOE отличается от приложения J-сцепления тем, что NOE происходит через пространство, а не через химические связи. Таким образом, атомы, которые находятся в непосредственной близости друг от друга, могут давать NOE, тогда как спиновая связь наблюдается только тогда, когда атомы связаны 2–3 химическими связями. Тем не менее, отношение η I S (макс) = 1 / 2 затемняет как НЭ связана с межъядерными расстояниями , так как оно применяется только для идеализированного случая , когда релаксация 100% доминируют диполь-дипольное взаимодействие между двумя ядрами я и S На практике значение ρ I содержит вклады от других конкурирующих механизмов, которые служат только для уменьшения влияния W 0 и W 2 за счет увеличения W 1 . Иногда, например, релаксация из-за электронно-ядерных взаимодействий с растворенным кислородом или примесями ионов парамагнитных металлов в растворителе может препятствовать наблюдению слабых усилений NOE. Наблюдаемый NOE при наличии других механизмов релаксации определяется выражением
η я знак равно σ я S ρ я + ρ * <\ displaystyle \ eta _ = <\ frac <\ sigma _
где ρ ⋇ — дополнительный вклад в общую скорость релаксации от механизмов релаксации, не связанных с перекрестной релаксацией. Используя ту же идеализированную двухспиновую модель для дипольной релаксации в пределе экстремального сужения:
ρ я ∝ τ c р 6 <\ displaystyle \ rho _ \ propto <\ frac <\ tau _
Легко показать, что
η я S ∝ ( τ c ρ * ) 1 р 6 <\ displaystyle \ eta _ ^ \ propto \ left (<\ frac <\ tau _
Таким образом, двухспиновый стационарный NOE зависит от межъядерного расстояния только тогда, когда есть вклад от внешней релаксации. Белл и Сондерс показали, что при строгих предположениях ρ ⋇ / τ c почти постоянна для подобных молекул в пределе экстремального сужения. Следовательно, взятие соотношений стационарных значений NOE может дать относительные значения для межъядерного расстояния r . Хотя стационарный эксперимент полезен во многих случаях, он может предоставить информацию только об относительных межъядерных расстояниях. С другой стороны, начальная скорость роста NOE пропорциональна r IS −6 , что обеспечивает другие более сложные альтернативы для получения структурной информации с помощью переходных экспериментов, таких как 2D-NOESY.
Двумерный ЯМР
Причины использования двумерного ЯМР для измерения NOE такие же, как и для других двумерных методов. Максимальное разрешение улучшается за счет распределения затронутых резонансов по двум измерениям, поэтому разрешается больше пиков, можно наблюдать более крупные молекулы и можно наблюдать больше NOE за одно измерение. Что еще более важно, когда молекулярное движение находится в режиме промежуточного или медленного движения, когда NOE либо равно нулю, либо отрицательно, стационарный эксперимент NOE не может дать результатов, которые могут быть связаны с межъядерными расстояниями.
Ядерная спектроскопия на эффекте Оверхаузера (NOESY) — это метод двумерной ЯМР-спектроскопии, используемый для идентификации ядерных спинов, подвергающихся кросс-релаксации, и измерения их скоростей кросс-релаксации. Поскольку 1 H диполь-дипольная связь обеспечивает первичные средства кросс-релаксации для органических молекул в растворе, кросс-релаксация претерпевает спины, близкие друг к другу в пространстве. Таким образом, кросс-пики спектра NOESY показывают, какие протоны находятся близко друг к другу в пространстве. В этом отношении эксперимент NOESY отличается от эксперимента COSY, который полагается на J-связь для обеспечения спин-спиновой корреляции, и чьи кросс-пики показывают, какие единицы H близки к другим единицам H через химические связи молекулы.
Базовая последовательность NOESY состоит из трех импульсов под углом 90 °. Первый импульс создает поперечную спиновую намагниченность. Спины прецессируют в течение времени эволюции t 1 , которое увеличивается в ходе двумерного эксперимента. Второй импульс создает продольную намагниченность, равную поперечной составляющей намагниченности, ортогональной направлению импульса. Таким образом, идея состоит в том, чтобы создать начальное условие для периода перемешивания τ m . Во время смешивания NOE может происходить перенос намагниченности посредством кросс-релаксации. Для базового эксперимента NOESY τ m поддерживается постоянным на протяжении всего 2D эксперимента, но выбирается для оптимальной скорости кросс-релаксации и нарастания NOE. Третий импульс создает поперечную намагниченность из оставшейся продольной намагниченности. Сбор данных начинается сразу после третьего импульса, и поперечная намагниченность наблюдается как функция времени задержки t 2 импульса . Спектр NOESY генерируется посредством двумерного преобразования Фурье по t 1 и t 2 . Проводят серию экспериментов с увеличением времени перемешивания, и отслеживают увеличение NOE. Самые близкие протоны показывают самые быстрые темпы нарастания NOE.
Межпротонные расстояния могут быть определены из однозначно заданных, хорошо разрешенных спектров NOESY с высоким отношением сигнал-шум путем анализа интенсивностей кросс-пиков. Они могут быть получены путем интегрирования по объему и могут быть преобразованы в оценки межпротонных расстояний. Расстояние между двумя атомами и может быть рассчитано из объемов кросс-пиков и масштабной константы я <\ displaystyle i> j <\ displaystyle j> V <\ displaystyle V> c <\ displaystyle c>
р NOE знак равно ( c V я j ) 1 / 6 <\ displaystyle r _ <\ text
где может быть определено на основе измерений известных фиксированных расстояний. Диапазон расстояний может быть представлен на основе известных расстояний и объемов в спектре, что дает среднее значение и стандартное отклонение , измерение нескольких областей в спектре NOESY, показывающее отсутствие пиков, то есть шума , и ошибку измерения . Параметр настроен таким образом, чтобы все известные расстояния находились в пределах погрешности. Это показывает, что может отображаться нижний диапазон громкости NOESY. c <\ displaystyle c> c <\ displaystyle c> c S D <\ displaystyle c_ V е р р <\ displaystyle V _ <\ rm м v <\ displaystyle m_ Икс <\ displaystyle x>
р NOE ниже знак равно ( c — Икс c S D 1 м v V я j + V е р р ) 1 / 6 <\ displaystyle r _ <\ text
и что верхняя граница равна
р NOE выше знак равно ( c + Икс c S D 1 м v V я j — V е р р ) 1 / 6 <\ displaystyle r _ <\ text
Такие фиксированные расстояния зависят от исследуемой системы. Например, заблокированные нуклеиновые кислоты имеют много атомов, расстояние между которыми в сахаре очень мало варьируется, что позволяет оценить гликозидные торсионные углы, что позволило ЯМР сравнивать предсказания молекулярной динамики LNA. РНК, однако, содержат сахара, которые являются гораздо более гибкими в конформационном отношении и требуют более широких оценок низких и высоких границ.
В работе с белками NOE используются для ограничения внутримолекулярных расстояний. В этом методе каждая пара протонов рассматривается отдельно, и интенсивности кросс-пиков NOESY сравниваются с эталонным кросс-пиком от протонной пары на фиксированном расстоянии, такой как пара геминальных метиленовых протонов или протонов ароматического кольца. Этот простой подход достаточно нечувствителен к эффектам спиновой диффузии или неоднородных времен корреляции и обычно может привести к определению глобальной складки белка при условии, что было идентифицировано достаточно большое количество NOE. Перекрестные пики NOESY могут быть классифицированы как сильные, средние или слабые и могут быть переведены в верхнее ограничение расстояния около 2,5, 3,5 и 5,0 Å соответственно. Такие ограничения затем можно использовать при оптимизации молекулярной механики, чтобы получить картину конформации состояния раствора белка. Определение полной структуры основано на различных экспериментах ЯМР и методах оптимизации, использующих как химический сдвиг, так и ограничения NOESY.
Экспериментальные методы
Некоторые примеры экспериментальных методов одно- и двумерного ЯМР, использующих NOE, включают:
- NOESY, Ядерная спектроскопия эффекта Оверхаузера
- HOESY, Гетероядерная спектроскопия эффекта Оверхаузера
- РОУЗИ, Ядерная спектроскопия на основе эффекта Оверхаузера с вращающейся рамой
- TRNOE, Перенесенный ядерный эффект Оверхаузера
- DPFGSE-NOE, эксперимент с двойным импульсным градиентом поля спинового эха NOE
NOESY — это определение относительной ориентации атомов в молекуле, например, в белке или другой большой биологической молекуле, создавая трехмерную структуру. HOESY — это NOESY взаимная корреляция между атомами разных элементов. ROESY включает спин-синхронизацию намагниченности, чтобы предотвратить ее стремление к нулю, что применяется для молекул, для которых обычный NOESY не применим. TRNOE измеряет NOE между двумя разными молекулами, взаимодействующими в одном растворе, как при связывании лиганда с белком. В эксперименте DPFGSE-NOE — переходный эксперимент, который позволяет подавить сильные сигналы и, таким образом, обнаружить очень маленькие NOE.
Примеры ядерного эффекта Оверхаузера
На рисунке (вверху) показано, как ядерная спектроскопия эффекта Оверхаузера может прояснить структуру переключаемого соединения. В этом примере протон, обозначенный как
Другой пример (внизу), где приложение, в котором NOE полезно для назначения резонансов и определения конфигурации, — это полисахариды. Например, сложные глюканы обладают множеством перекрывающихся сигналов, особенно в протонном спектре. Следовательно, полезно использовать эксперименты 2D ЯМР, включая NOESY, для определения сигналов. См., Например, NOE углеводов .
Источник